3-3-11- برش وکتور pET-21a (هضم شده با Nde?) توسط BamHI43
3-3-12- لیگاسیون وکتور pET-21a و ژن سنتتیک dr241844
3-3-13- ترنسفورماسیون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5?45
3-4- توالییابی ژن سنتتیک در pET-21a45
3-5- القاء ساختارهای بیانی pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور تولید پروتئین DR2418 دارای برچسب هیستیدین (His-tagged r-dR2418):46
3-6- ارزیابی پروتئین DR2418 تولید شده به وسیله الکتروفورز در ژل پلی آکریلامید (SDS-PAGE)47
3-7- یکسان سازی غلظت کلی پروتئینها در نمونه های قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE50
3-8- شناسائی و تائید پروتئین His-tagged r-DR2418 با روش Western blot50
3-9- نگهداری و ذخیره باکتریهای مولد پروتئین ِDR2418:52
3-10- بررسی پایداری پلاسمیدها (Plasmid stability Test)53
3-11- خالصسازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی53
3-11-1- لیز سلولی باکتری E.coli54
3-11-2- آماده کردن ستون54
3-11-3- تزریق نمونه و شستشو55
3-11-4- جدا سازی یپروتئین نوترکیب55
3-11-4-1- روش دیالیز56
3-11-5-1- رسم منحنی استاندارد56
3-11-5-2- تهی? محلول برادفورد57
3-11-6- بازیافت و نگهداری ستون57
فصل چهارم : نتایج58
4-1- غربال کردن کلنی های حاوی pGEM-B1 دارای قطعه DR2418:59
4-2- غربال کردن کلنیهای E. coli DH5 حاوی pGEM-B1 دارای قطعه59
4-2-1- تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI:60
4-2-2- تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI:60
4-3- جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation:61
4-3-1- تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی:63
4-4- ترانفسفورم وکتور pET21a حاوی ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزیابی بیان پروتئین DR2418:64
4-5- شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش Western Blot Wet transfer))64
4-6- بیان ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت66
4-7- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE:67
4-8- نتایج سنجش غلظت پروتئین:67
فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری69
ضمیمه:76
پیشنهادات:84
منابع85
چکیده انگلیسی91
فهرست شکل ها
عنوانصفحه
شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن5
شکل 2. سینتیک ترمیم ژنوم D .radiodurans و T. gammatolerans بعد از اینکه در معرض اشعه گاما قرار می گیرند.11
شکل 3. مسیرهای مختلف ترمیم DNA دورشته ای12
شکل 4. مدل شماتیک از ارتباط حیات باکتری و پروتئین PprI و مسیرهای فعال شده.17
شکل 5: ساختار شیمیایی سیتونمین23
شکل 6: تولید سیتونمین در حضور تابش فرابنفش.26
شکل 7. الکتروفورز پلاسمیدهای استخراج شده از کلنی های ترانسفورم شده با pGEM-B1 دارای قطعه.59
شکل 8. هضم آنزیمی پلاسمیدهای pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک توسط آنزیم NdeI60
شکل 9. هضم آنزیمی پلاسمیدهای pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک خطی شده توسط آنزیم BamHI61
شکل 10. جداسازی قطعه ژن سنتتیک از روی ژل بمنظور تخلیص آن62
شکل 11. لاین 1: وکتور pET 21a، لاین 2 تا 5: وکتور pET 21a حاوی ژن سنتتیک62
شکل 12. نتایج همردیفی پلاسمید pET21a حاوی ژن مورد نظر (T7 promoter) و ژن سنتز شده (Synthesized).63
شکل 13. بررسی الگوی پروتئینی DR2418 بیان شده در E. coli Origami65
شکل 14. شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش وسترن بلات65
شکل 15. تایید بیان پروتئین DR2418 در حجم یک لیتر محیط کشت با روش SDS-PAGE:66
شکل16. برسی پروتئین DR2418 بعد از تخلیص از روی ستون کروماتوگرافی بر روی ژل SDS_PAGE67
فهرست جداول و نمودارها
عنوانصفحه
جدول 1: محصولات متابولیکی میکروبی تولید شده ناشی از القاء پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی آنها.20
جدول 2: نقش دارویی اکستریمولیت های جداسازی شده از اکستریموفیل های مقاوم به پرتو فرابنفش24
نمودار1: منحنی استاندارد (کالیبراسیون) غلظت؛ رسم شده با استفاده از غلظتهای 50، 100، 250 و 500 میلیگرم در لیتر محلول BSAدر طول موج 595 نانومتر68
چکیده
زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.
روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با استفاده از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.
نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد.
نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که پروتئین rDR2418 می تواند به عنوان یک کاندید مناسب پروتئین مقاوم به پرتو در نظر گرفته شود. بااین حال، خاصیت مقاومت به پرتو پروتئین DR2418 باید در سیستم های پروکاریوتی و یوکاریوتی آنالیز شود.
فصل اول:
مقدمه و کلیات
محیطهای دارای پرتوزایی جزء محیطهای خشن (Extreme) میباشند و در این محیطها میکروارگانیسمهای مقاوم به اشعههای رادیواکتیو در خانوادههای مختلف باکتریایی یافت میشوند. به عنوان مثال گونههای جنس Deinococcus حتی در دوزهای 25 KGy از خود مقاومت نشان میدهند که یکی از معروفترین گونههای متعلق به جنس Deinococcus و مقاوم به اشعه، Deinococcus radiodurans میباشد، بطوریکه این باکتری حتی در پرتوهای با دوز بالا به حیات خود ادامه میدهد. این باکتری جزء باکتریهای غیر بیماریزا است و میتوان آن را از محیطهای طبیعی جداسازی نمود و در محیطهای کشت آزمایشگاهی آن را کشت داد. مطالعات مختلفی در مورد مکانیسم مقاومت Deinococcus radiodurans به اشعه رادیواکتیو انجام شده است و مطالعات نشان میدهد که ژنهای کدکننده پروتئینهای دخیل در ایجاد مقاومت به اشعه در این باکتری وجود دارد ولی مکانیسم مولکولی آن هنوز بطور کامل مشخص نشده است. با این حال مطالعات اخیر ژنهای مختلفی از قبیلDR2418، DR1709، pprI، RecX را گزارش کردهاند که در ایجاد مقاومت به اشعه دارای نقش بسزایی میباشند و عملکرد آنها در زمینه از بین بردن رادیکالهای سمی اکسیژن و ترمیم DNA آسیب دیده میباشد.
محیطهای خشن (Extreme) یکی از محیط های پرچالش برای ارگانیسم های زنده است. با این حال، تعداد زیادی از میکروارگانیسمهای متعلق به سه قلمرو حیات (باکتریها، یوکاریوتها و آرکیها) از محیطهای خشن مانند هیدروترمال و محیطهای خشک در معرض اشعه UV، محیط های بسیار گرم جداسازی شده اند. در میان این ارگانیسمهای مقاوم به شرایط خشن، باکتریهای متعلق به خانواده Deinococcaceae توانایی بسیار بالایی برای زیستن در محیط های در معرض اشعه های یونیزان دارند و Deinococcus radiodurans یکی از بهترین گونه هایی است مورد مطالعه قرار گرفته است.
این باکتری توسط توانایی استثنایی اش در مقابله با اثرات تخریب کننده ساختار DNA از جمله اشعه یونیزان، نور ماورای بنفش و شرایط خشکی مورد شناسایی قرار گرفته است.
اشعههای یونیزان توسط تخریب عناصر رادیواکتیو تولید می شود و منجر به تولید الکترون ها و یون های مختلف می شود. اشعه های گاما فوتون هایی هستند که مولکول های سلولی را تغییر می دهند و رادیکال های هیدروکسیل بسیار فعال تولید می کنند (ROS) بخصوص OH. توسط یونیزاسیون مولکول های آب. این رادیکال های آزاد بطور مستقیم و غیرمستقیم باعث تخریب DNA می شوند و تغییرات بازی و شکست دورشته و تک رشته DNA را بوجود می آورند. مطالعات نشان می دهد که 80% از تخریب DNA ناشی از عملکرد ROS است و فقط 20% توسط برهم کنش مستقیم فوتون های گاما و DNA است و تعداد شکست های DNA دو رشته ای نسبت مستقیم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E , 2001). اولین مسیر حفاظت علیه استرس اکسیداتیو وجود آنزیم های آنتی اکسیدان همانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز است که بیومولکول ها را از آسیب هاب ناشی از ROS محافظت می کند (شکل 1). سوپراکسید دیسموتاز تبدیل اکسیژن را به سوپراکسید اکسیژن کاتالیر می کند تا در نهایت پراکسید هیدروژن به H2O تبدیل شود (شکل 1). مطالعات نشان می دهد که D. radiodurans در هنگام مواجه با اشعه یونیزان سه نوع سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز کد می کند. در آرکی ها، سوپراکسید دیسموتاز توسط ارگانیسمهای هوازی (نظیر Halobacterium) و چند ارگانیسم بی هوازی مانند Methanosarcina barkeri کد می شود. در ارگانیسم های بی هوازی سوپراکسید ردوکتاز (SOR) کد می شود (شکل 1). سوپراکسید ردوکتاز در هنگام اکسیده شدن نیاز دارد تا توسط روبردوکسین احیا شود که خودش هم توسط آنزیم NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز (NROR) اکسیده می شود. در نهایت پراکسید به H2O توسط عملکرد روبرترین تبدیل می شود. علاوه بر این، بعضی از ارگانیسم های بی هوازی، از مسیرهای بدون تولید پراکسید هیدروژن، برای حذف سوپراکسید استفاده می کنند (تصویر C1). مطالعات کریستالوگرافی نشان می دهد که سوپراکسید ردوکتاز با فروسیانین کمپلکس تشکیل می دهد (Adam V , 2004). این کمپلکس بطور موثر با رادیکال های سمی اکسیژن واکنش می دهد و محصول نهایی واکنش پراکسید هیدروژن نیست اما فورمات و H2O تولید میشود (شکل 1).
شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن در (A) هوازی ها و ارگانیسم های بی هوازی (B و C). Cyt bd: سیتوکروم bd یوبی کوئینول اکسیداز. Prx: پروکسی ردوکسین، rd: روبردوگسین، SOD: سوپراکسید
دیسموتاز، SOR: سوپراکسید ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز.
در این تحقیق در نظر است پروتئین DR2418 به صورت نوترکیب تهیه تا در تحقیقات آتی از آن استفاده شود.
به طور خلاصه اهدف این تحقیق به شرح زیر است:
_ با توجه به اینکه ژنهای ایجادکننده مقاومت به اشعه در باکتری Deinococcus radiodurans وجود دارد، می توان عملکرد این ژنها را در مقیاس آزمایشگاهی بررسی نمود. بنابراین هدف از این مطالعه، تهیه پروتئینی بود که در مقاومت باکتری نسبت به پرتو نقش دارد. در تحقیقات آتی میتوان از آن برای تهیه مواد ضدپرتو استفاده نمود.
_ کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بیانی pET21
_ بررسی میزان بیان پروتئین DR2418 در میزبان E.coli origami
_ خالصسازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

فصل دوم:
مروری بر تحقیقات انجام شده
پیشینه تحقیق:
یکی از شگفت انگیز ترین ارگانیسم های کشف شده تا به امروز Deinococcus radiodurans می باشد. این باکتری در سال 1956 توسط Artthur W. Anderson کشف شد. در حالیکه آرتور برای استریل کردن کنسروهای گوشت از اشعه گاما استفاده کرده بود بعد از مدتی متوجه فساد گوشت کنسرو شده شد و تنها میکرو ارگانیسمی که توانست از گوشت جدا کند Deinococcus radiodurans بود.ژنوم این باکتری در سال 1999 توسط Tiger A توالی یابی شد و تحلیل و بررسی دقیق ژنوم باکتری در سال 2001 به پایان رسید.
Deinococcus radiodurans توانائی های مختلفی در جلوگیری از آسیب های اشعه رادیو اکتیو و همچنین ترمیم DNA تک رشته ای خود دارد. D.radiodurans یک باکتری نسبتا بزرگ ، کروی است که معمولا 4 سلول به هم متصل شده و تشکیل تتراد می دهند.
در مطالعه انجام شده توسط WANG LiangYan و همکارانش در سال 2012 نشان داده شد که بیان همزمان PprI و DR2418 در سلول E. coli حفاظت بخشی علیه اشعه گاما و ترمیم DNA را افزایش می دهد بطوریکه موتانت های فاقد این دو ژن بسیار حساس تر به اشعه گاما هستند. هم چنین موتانت های فاقد PprI و DR2418، در دو ژن recA و PprA کاهش بیان دارند و در بازآرایی ژنوم نقص دارند و مقاومت آن ها به اشعه کاهش می یابد. علاوه بر این، نتایج این مطالعه نشان داد که حذف ژنی PprI در سویه های وحشی اشعه دیده باعث کاهش بیان DR2418 می شود. بنابراین، تولید پروتئین PprI بیان drRRA را تحت تاثیر قرار می دهد. هم چنین یک پروتئین جدید به نام PprM (Cold shock protein) در پاسخ به اشعه نقش دارد که توسط ژن PprI کنترل می شود (WANG L, 2012).
Duohong Sheng و همکارانش در سال 2005 نشان دادند که پروتئین RecX در باکتری داینوکوکوس به عنوان یک رپرسور برای بیان recA عمل می کند و افزایش بیان RecX مقاومت پذیری سلول را برای اشعه گاما کاهش می دهد. هم چنین نتایج این مطالعه نشان داد که RecX در باکتری داینوکوکوس فعالیت آنتی اکسیدانتی را مهار می کند (Jong ll K, 2009). Tian و همکاران در گزارش خود الکتروفورز دو بعدی انجام دادند که توانستند در بین ده سویه وحشی داینوکوکوس یک سویه با باند پروتئینی متفاوت، که پروتئین DR2418 نامیده شد، شناسایی کنند.
در مطالعات قبلی نشان داده شده است که متابولیسم آنتی اکسیدانتی در باکتری های مقاوم به اشعه نقش بسیار مهمی دارد. مطالعات نشان می دهد که پروتئین DR2418 در باکتری D. radiodurans می تواند بطور قابل توجهی بیان ژن های recA و pprA را القا کند و فعالیت آنزیماتیک کاتالاز را در این باکتری افزایش دهد. موتانت های DR2418 به اشعه گاما بسیار حساس هستند و قابلیت سلول برای جلوگیری از آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد بطور قابل توجهی کاهش می یابد (P.R.Bianco, 1998). پروتئین recA نقش بسیار حساس در نوترکیبی هومولوگ و تنظیم سیستم ترمیمی SOS دارد که نقش شکست پروتئولیتیکی رپرسور LexA در باکتری E. coli دارد که منجر به فعال سازی رگولون SOS می شود. ژن recA در باسیلوس سوبتیلیس توسط رونویسی فاکتور ComK فعال می شود که برای از بین بردن LexA لازم است. recA در D. radiodurans مقاوم به اشعه شباهت های عملکردی با recA در باکتری E. coli و باسیلوس سوبتیلیس دارد که از نظر توالی اسیدآمینه ای همانند هم هستند. سویه های موتانت recA نسبت به سویه های وحشی بسیار حساس به اشعه هستند. پروتئین DR2418 فقط در D. radiodurans وجود دارد و در سایر سویه ها و باکتری های مقاوم به پرتو وجود ندارد. رادیکال های اکسیژن و هیدروژن پرکسید از شکست مولکول های آب توسط اشعه بوجود می آید که منجر به آسیب به غشای سلولی، DNA و پروتئین می شود (C.Bonacossa, 2002). در مطالعات نشان داده شده است که سویه های E. coli حاوی ژن dr2418 دارای فعالیت نسبی بیشتر در از بین بردن رادیکال های سمی اکسیژن هستند. مکانیسم دفاعی معمول در سلول علیه O2•- و H2O2 توسط آنزیم های دارای فعالیت آنتی اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز انجام می گیرد. بیان ژن PprI در E. coli منجربه افزایش بیان KatG می شود که با افزایش دوز اشعه گاما میزان بیان KatG افزایش می یابد (Ohba H,2009).
در مطالعه ای که توسط Huiming Lu و همکاران در سال 2009 صورت گرفت نقش پروتئین Ppr1 و نقش تنظیمی آن بعد از قرار گرفتن باکتری Deinococcus radiodurans در معرض تابش شدید اشعه مشخص شد. آن مطالعه بر اساس مقایسه بین سویه وحشی R1 و سویه ای که ژن Ppr1 آن حذف شده بود صورت گرفت و مشخص شد در سویه وحشی یک سری از ژن ها به دنبال Ppr1 بیان شده و فعالیت های مختلفی از جمله رونویسی ، متابولیسم ، و ترمیم به صورت کامل تر و متفاوت با سویه فاقد ژن Ppr1 پیش می رود و سویه وحشی توانایی بالاتری در مقایسه با سویه فاقد ژن Ppr1 در مواجهه با اشعه رادیو اکتیو دارد.(Huiming Lu, 2009).
2-1- ترمیم شکستگیهای DNA دورشتهای:
شکست های DNA دورشته ای بسیار خطرناک بوده و باید ترمیم گردد. با این حال، باکتری D .radiodurans و آرکی T. gammatolerans میتوانند دوزهایی از اشعه گاما را تحمیل شوند که هزاران شکست در طول DNA دورشتهای و در طول ژنوم ایجاد می کند. پروتئین های مختلفی در ترمیم DNA دخیل هستند. سنتیک ترمیم شکستگی DNA دورشته ای در D .radiodurans بعد از مواجه شدن با 6800 Gy اشعه گاما خیلی سریع است و هنگامی که سلول ها بعد از مواجه شدن با اشعه در محیط کشت غنی قرار می گیرند بعد از دو تا سه ساعت خود را ترمیم می کند (Krisko A , 2013) (شکل 2).
شکل 2. سینتیک ترمیم ژنوم D .radiodurans و T. gammatolerans بعد از اینکه در معرض اشعه گاما قرار می گیرند. D .radiodurans و T. gammatolerans در طی فاز رشد لگاریتمی به ترتیب در دوزهای 6800 Gy یا 5000 Gy اشعه گاما قرار گرفتند و سپس در محیط کشت غنی شده در دمای 30 درجه سانتی گراد برای D. radiodurans و 85 درجه سانتی گراد برای T. gammatolerans جهت ترمیم خود قرار گرفتند. جهت جلوگیری از شکست مکانیکی DNA در آزمایشگاه سلول ها محبوس شدند و با آنزیم محدودالاثر بریده شدند.
2-2- مکانیسم ترمیم شکستگی DNA دورشته ای:

چندین مکانیسم برای ترمیم موثر DNA دورشته ای نشان داده شده است. جهت ترمیم DNA توسط روش نوترکیبی هومولوگ، متصل شدن تک رشته ای (SSA) یا سنتز رشته ها وابسته به چسبیدن رشته (ESDSA)، سلول ها نیاز به یک کپی کامل دیگر از DNAآسیب دیده باشند. بر خلاف آن، اتصال انتهایی غیرهومولوگ (NHEJ) به کپی دوم از DNA جهت اتصال رشته های کانتیگ نیاز ندارند (Hefferin ML, 2005).
2-2-1- نوترکیبی هومولوگ (HR):
مسیر اصلی در ترمیم شکست DNA در باکتری ها و مخمر ساکارومیسس سرویزیه است. HR از DNA هومولوگ کامل برای ترمیم توالی های آسیب دیده DNA استفاده می کند. اولین مرحله ترمیم DNA دورشته ای توسط روش نوترکیبی هومولوگ، پردازش انتهای DNA برای بوجود آوردن DNA تک رشته ای آویز وجود دارد که RecA در باکتری ها و RadA در آرکی ها و Rad51 در سلول های یوکاریوتی برای تشکیل رشته های نوکلئوپروتئین فراخوانی می شوند. مرحله بعدی HR تعویض رشته های DNA است (Setiz EM, 1998).
شکل 3. مسیرهای مختلف ترمیم DNA دورشته ای
2-2-2- اتصال تک رشته (SSA):
علاوه بر نوترکیبی هومولوگ، SSA نشان داده شده است در سلول های اشعه دیده داینوکوک اتفاق می افتد، بطوریکه شکست DNA دورشته ای ترمیم می شود. فرایند SSA می تواند اتفاق بیافتد اگر دورشته DNA آسیب دیده در یک منطقه از کروموزوم وجود داشته باشند. بعد از واکنش انجام شده توسط اگزونوکلئاز، DNA آویز شده تک رشته ای ایجاد می شود. اگر DNA آویز شده دارای توالی های مکمل باشد، آنها می توانند به هم متصل شوند. سپس، منطقه تک رشته ای موجود در کروموزوم دوباره ساخته شده توسط سنتز DNA پر می شود.
2-2-3- سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA):
Zharadka و همکارانش در سال 2006 یک مدل از SSA به نام ESDSA پیشنهاد کردند، بر طبق این مدل، انتهای تک رشته یک قطعه به قطعه هم پوشان حمله می کند و سنتز DNA آغاز می شود. با این حال، بر خلاف آنچه که در همانندسازی کلاسیک DNA می شود، قطعات تک رشته ای تازه سنتز شده DNA توسط جابجاشدگی D-loop ایجاد می شود. اگر انتهای قطعات DNA تک رشته ای تازه شنتز شده مکمل هم باشند می توانند به هم متصل شوند و تشکیل DNA دورشته ای بلند تسهیل می شود که در نهایت این رشته ها به هم متصل شده و DNA حلقوی را ایجاد می کند (Zahra dka K, 2006).
اغلب تغییرات بحرانی و خشن در محیط سلول ها، یک سری از ژن ها را که محصول پروتئینی آنها از سلول حفاظت می کند، فعال و بیان میکند. این محصولات باعث کاهش اثرات بحرانی و خشن در سلول می شوند. یکی از مکانیسم ها که در بین همه سلول ها دیده شده است، مکانیسم Heat shock response است. معمولا در مواردی که سلول در تغییرات دمای بالا قرار گرفته است. پروتئین های heat shook پایداری و ترمیم پروتئین هایی از سلول که تا قسمتی دناتوره شده اند را باعث می شوند. سلول ها همچنین دارای مکانیزم هایی هستند که سطح آنزیم های ترمیم DNA را مثل یک حالت اورژانسی در پاسخ به آسیب دیدگی DNA بالا می برد. بهترین مورد مطالعه شده در E. coli گزارش شده است . این سیستم به نام پاسخ SOS خوانده می شود . هر عاملی که جلوی سنتز مولکول DNA را بگیرد و باعث آسیب به دو رشته ای DNA گردد یک سیگنال القایی برای افزایش نسخه برداری بیشتر از ?? ژن را پدید می آورد که بیشتر این ?? ژن برای بیان پروتئین هایی هستند که در ترمیم DNA نقش دارند . این سیگنال القایی به نظر می رسد حضور DNA تک رشته ای است که در ابتدا پروتئین RecA را فعال می کند. پروتئین RecA قادر است مهار کننده نسخه برداری یک سری بزرگ از ژن ها را تخریب کند و در نتیجه پاسخ SOS از این جا آغاز می گردد ولی در کنار آن جهش هم وجود دارد که به آن Error prone می گویند. سلول ها هم چنین یک مکانیسم دیگر برای کمک به پاسخ ترمیمی مولکول DNA دارند. آنها از پیشرفت سیکل مولکولی جلوگیری می کنند تا زمانی که ترمیم DNA کامل شود . پروتئین SalA یکی از پروتئین های حاصل پاسخ SOS است که از پیشرفت تقسیم سلولی جلوگیری می کند (Sriniva san S, 2012).
2-3- ساختار نوکلئوتید
کروموزوم باکتریایی با یکسری از پروتئین ها در ارتباط است که یک ساختار فشرده به نام نوکلئوئید را ایجاد می کند. ساختار نوکلئوئیدی اجزای خانواده جنس Deinococcus و Rubrobacter دارای فشردگی بالایی هستند و بعد از اشعه دهی گاما بدون تغییر باقی می ماند. انتشار محدود انتهای DNA ممکن است یک توضیح مناسبی برای ترمیم پربازده شکست های DNA دورشته ای باشد که در معرض دوزهای بالای اشعه قرار گرفته است. هم چنین مطالعات نشان می دهد که 4 تا 10 کپی از ژنوم داینوکوکوس رادیودورانس همردیف می شوند و جستجوی هومولوژی برای ترمیم شکستگی های DNA دو رشته ای راحت می شود. در E. coli تعداد فراوانی از پروتئین های HU مشابه هیستون با نوکلئوئید باکتری ارتباط دارد و در سلول های اشعه دیده با اشعه گاما بسیار حایز اهمیت است. در D. radiodurans پروتئین HU در بقای سلول حایز اهمیت است و از یک پلاسمید حساس به حرارت بیان می شود و نقش مهمی را در سازمان ساختار نوکلئوئید ایفا می کند (Zimmerman, 2005).
2-4- پاسخ سلول های داینوکوکوس متعاقب اشعه گاما:
آنالیز ترانسکریپتوم D. radiodurans یک گروه جدید از ژنهایی را نشان میدهد که در پاسخ به اشعه های یونیزان و خشکی بیشتر بیان می شوند. در میان 72 ژن که در طی یک ساعت بعد از اشعه گرفتن بشیتر بیان می شوند و همینطور 33 ژن بعد از ایجاد شرایط خشکی در این باکتری بیان می شوند. فقط تعداد محدودی از ژن های دخیل در فرایند ترمیم DNA مانند RecA در میان این ژن ها وجود دارد. 5 ژن که در پاسخ به استرس به میزان زیاد بیان می شوند عبارتند از ddrA، ddrC، ddrD و pprA. این ژن ها در D. geothermalis و D. deserti بصورت حفاظت شده وجود دارد. ، پروتئین DdrA با میل ترکیبی بالا به تک رشته DNA و به انتهای ‘3 متصل می شود و آن را از تخریب توسط اگزونوکلئازI محافظت می کند. همچنین DdrA در پایداری سوبستراهای نوترکیب ، به ویژه در حضور تعداد زیادی از شکست های DNA دخیل است. پروتئین DdrB با میل ترکیبی بالا به DNA تک رشته متصل می شود و اتصال مکمل DNA تک رشته را تحریک می کند. مشخص شده است کهDdrB برای ترانسفرماسیونDNA پلاسمیدی ضروری است و پیش و پس از تابش به نوکلئوئید به صورت گذرا به کار گرفته می شود. DdrB بازسازی قطعات کوچک بی شماری را توسط فرآیند اتصال تک رشته (SSA) برای تولید سوبسترهای مناسب برای ESDSA تسهیل می کند ((Alice Devigne1, 2013. PprA از تجزیه انتهای DNA دورشته ای حفاظت می کند و فعالیت DNA لیگاز را تحریک می کند و نقش PprA را در مسیر NHEJ نشان می دهد. هم چنین سه سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز بیومولکولهای سلولی را از رادیکال های سمی اکسیژن محافظت می کند (Imly JA, 2003).
2-5- ژن های دخیل در مقاومت بخشی به اشعه:
مطالعات توالی یابی ژنوم در مورد باکتریهای D. radiodurans R1 و D. geothermalis به اتمام رسیده است. مطالعات ژنتیکی سویه های حساس به اشعه داینوکوکوس باعث شده است که ژن های جدید تنظیمی جدید از قبیل dr0167 که جدیدا PprI نام دارد کشف شود. پروتئین PprI می تواند رونویسی recA و pprA را تحریک کند که پروتئین های دخیل در ریکامیناسیون می باشند. بطور قابل توجهی، افزایش بیان ژن PprI در E. coli تحت کنترل GroESL ترمیم DNA و حفاظت بخشی علیه آسیب های اکسیداتیو را افزایش می دهد. هم چنین، مطالعات نشان می دهد که پروتئین PprI دارای توالی های مشابه با دو موتیف عملکردی است: موتیف روی متالوپپتیداز (Zinc-binding signature) و پروتئین تنظیمی باکتریایی (lacI family signature) که نشان می دهد که این پروتئین دارای فعالیت عملکردی است. هم چنین این ژن توسط Battista و هم کارانش شناسایی شد و irrE نام گرفت. مطالعات نشان می دهد که حذف کامل ژن PprI بیان ژن recA را تحت تاثیر قرار می دهد. محصول ژن recA برای ترمیم DNA باکتری داینوکوکوس در شرایط آسیب DNA بسیار ضروری است. ژن PprA نیز یکی دیگر از ژنهایی است که در ترمیم DNA نقش دارد و توسط ژن PprI کنترل می شود. در شرایطی که سلول میکروبی تحت تاثیر اشعه قرار میگیرد مرگ سلولی توسط هیدروژن پراکسید و رادیکال های سمی اکسیژن اتفاق میافتد (آسیب غشای سلولی، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک) ولی پروتئین PprI خاصیت آنتی اکسیدانتی دارد و باعث حفاظت بخشی سلول میشود. پاسخ به آسیب DNA توسط مسیرهای سیگانال ترانسداکشن، ترانسدیوسرها و افکتورها انجام می شود. فعال شدن PprI به عنوان یک سوئیچ، بیان بسیاری از ژن های دخیل در ترمیم DNA مانند recA، pprA و کاتالاز را فعال میکند. با این که این ژن مختص باکتری داینوکوکوس میباشد ولی مطالعات در سیستم های یوکاریوتی نیز در حال انجام میباشد (Ghosal D, 2005). بیان ژن PprI در E. coli ترمیم DNA و حفاظت بخشی اکسیداتیو را افزایش می دهد و باعث حفاظت بخشی علیه اشعه می شود (شکل 4).

شکل 4. مدل شماتیک از ارتباط حیات باکتری و پروتئین PprI و مسیرهای فعال شده.
شبکه تنظیمی: در E. coli، ترمیم آسیب DNA در القای عملکرد SOS است که این فرایند درگیر فرایندهایی است که توسط RecA و LexA میانجیگری میشود. D. radiodurans دارای دو مولکول لومولوگ LexA است که بعد از تخریب DNA، RecA فرایند ترمیم را میانجی گری می کند. با این حال، در D. radiodurans هیچ رگولون تحت کنترل پروتئین های LexA1 و LexA2 شناسایی نشده است (Ghosal D, 2005).
2-6- منابع میکروبی مقاوم به پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی:
منابع متابولیکی میکروبی (یعنی اکستریمولیت) ترکیباتی آلی هستند که منحصر به فرد بوده و به طور مستقیم در رشد طبیعی، توسعه و یا تولید مثل موجودات درگیر نیست؛ با این حال، به علت عدم وجود اثر آنها در طولانی مدت موجب اختلال در بقای ارگانیسم، باروری و یا ریخت شناسی آن می گردد. این ذخایر میکروبی به طور گسترده ای از لحاظ اهمیت صنعتی بررسی شده اند، با این حال، پیامدهای درمانی همچنان باقی مانده تا مورد بررسی قرار گیرد. سازگاری میکروبی در زنده ماندن در شرایط اکستریم وابسته به متابولیسم منحصر به فردی است که یک عامل کلیدی در تنوع گسترده میکروبی است. ظهور ابزارهای تحلیلی عمده در ژنومیکس، پروتئومیکس و متابولومیکس، در تعیین ژن ها و پروتئین هایی که ممکن است در تنظیم ذخایر متابولیک میکروبی در شرایط سخت محیطی کمک نماید امروزه از توجه بالایی برخوردار است. در طول دهه گذشته، پیشرفت های شگفت انگیزی در تحقیقات در ارتباط با عوامل مختلف ضد سرطان با مطالعه موجودات زنده دریایی، که تحت شرایط بسیار سخت زنده مانده اند، به ثمر رسیده است (Makarova KS, 2007).
جدول 1 به طور خلاصه تعدادی از محصولات میکروبی که تولید آنها تحت تابش فرابنفش القاء گردیده و دارای پیامدهای درمانی و یا کاربردی میباشند، ذکر گردیده است. بعضی از آنها از اکستریموفیلهای دریایی مشتق شده اند. برای بهره برداری از اکستریمولیتهای حاصل از اکستریموفیلهای مقاوم در برابر اشعه در کاربرد های درمانی، جداسازی میکرو ارگانیسمها میبایست تحت شرایط سخت زندگی خود صورت پذیرد. شرایط سخت محیطی مانند سطوح بالایی از اشعه UVB، مواد مغذی کم و محتویات فلزات سنگین که در ارتفاعات بالاتر یافت میشوند. از آنجا که در ارتفاع بالا، تابش فرا بنفش یکی از محدود کننده ترین عوامل غیرزنده برای جوامع میکروبی بوده و در نتیجه، میتوان پیش بینی نمود که میکروارگانیسمهای جدا شده از ارتفاعات بالاتر دارای خواص مقاومت به تابش پرتو فرا بنفش میباشند. همراه با ارتفاعات بالاتر، سایتهای آلوده با زبالههای رادیو اکتیو نیز به عنوان یک منبع حاوی میکروبهای مقاوم در برابر اشعه پیشنهاد شده است. Asker و همکارانش سویههای Deinococcus depolymerans که مقاوم به پرتو های فرابنفش و گاما بوده را از سایتهای رادیو اکتیو ژاپن جداسازی نمودهاند. این سویههای حاوی رنگدانههای قرمز بوده، که فرض بر این است که عمل مقاومت میکروبی در برابر تابش با انرژی بالا، بر عهده این رنگدانهها میباشد (Singh S,P,2010).
جدول 1: محصولات متابولیکی میکروبی تولید شده ناشی از القاء پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی آنها.

2-7- فواید اکستریموفیلهای مقاوم در برابر تابش
ذخایر متابولیک ثانویه اکستریموفیل ها (به عنوان مثال، اکستریمولیت و اکستریموزیم ها) به طور مستقیم در بقاء، رشد، توسعه، و تولید مثل ارگانیسم دخیل نیست. با این حال، حضور این متابولیت های ثانویه به هنگام قرار گرفتن در معرض تابش بر بقای میکروبی مؤثر است. ویژگی های منحصر به فرد اکستریمولیت ها شرایطی فراهم آورد تا برنامههای کاربردی گسترده ای در بیوتکنولوژی، در محدوده پاکسازی زیستی زباله های هستهای و تولید داروهای مهم پزشکی توسط Singh و Gabani مورد بررسی قرار گیرد (Asker D,2010 و Singh OV, 2011) .
2-7-1- پیامدهای دارویی اکستریمولیت های مقاوم در برابر تابش
پیشرفت های صورت گرفته در تحقیقات اکستریموفیل های تولید کننده اکستریمولیت، نشانه هایی جهت ساخت داروهای ضد سرطان فراهم آورد. تا به امروز، چندین ترکیب حفاظتی در برابر تابش فرابنفش از اکستریموفیل های مقاوم به پرتو، از جمله اسیدهای آمینه مشابه مایکوسپورین 1(MAA)، سیتونمین2، اکتوئین3، باکتریوروبرین4، اسفاروفورین5، پانارین6 و ملانین7 جداسازی شده است. در جدول 1 خلاصه ای از محصولات مختلف متابولیک میکروبی که از اکستریموفیل های مقاوم در برابر تابش فرابنفش جداسازی شده و پیامدهای دارویی آنها بیان گردیده است (Shick JM,2002).
MAA توسط یک cyclohexenone یا هسته cyclohexenimine کنژوگه شده با نصف نیتروژن یک اسید آمینه شناخته شده است و توسط مسیر اسید shikimic از طریق اسید 3-dehydroquinic و
4-deoxygadusol تولید می گردد، که به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی شناخته شده است. MAA از جلبک های قرمز، ستاره دریایی، مرجان ها، ، دینوفلاژل ها و سیانو باکتری ها تحت تابش UVB جداسازی شده است. مایکوسپورین جدید جدا شده از آسکومیست Collema cristatum؛ اثر حفاظت بخش خود را در برابر تخریب غشاء ناشی از تابش فرا بنفش ، تشکیل دایمر پیریمیدین و اریتم در کراتینوسیت های کشت شده انسانی، نشان داد . با توجه به توانایی MAA در جذب تابش فرا بنفش، این ترکیبات می تواند به ضد آفتاب های UV اضافه گردد. مشخص شده توانایی ضد آفتاب MAA زمانی که این ترکیبات در خارج سلول اعمال شوند تا حد زیادی افزایش یافته است ، که نشان دهنده نقش آنها در جذب نور می باشد؛ که به منظور افزایش اثرات محافظتی می توان در صنعت لوازم آرایشی و بهداشتی مورد استفاده قرار گیرد (Dela coba F, 2009). نقش فیزیولوژیکی جایگزین برای MAA به عنوان آنتی اکسیدان مطرح است. برخی از انواع MAA (جدول 2) به عنوان از بین برندهی ROS ناشی از قرار گرفتن در معرض تابش فرابنفش، شناخته شده اند. در دیگر گونه هایی از اکستریموفیل هایی کهMAA تولید می کنند، بیوسنتز همچنین می تواندتوسط شوک اسمزی القاء گردد.

دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید