1-15-4 انتخاب الگوریتم26
بررسی کارآیی الگوریتم مورد استفاده در تجزیه کلاستر26
شاخص شانون27
بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها براساس آنالیز Nei27
سابقه تحقیق28
1-15-1- مروری بر برخی پژوهشهای انجام شده بر روی Quercus brantii Lindl.28
1-15-2- مروری بر برخی پژوهشهای انجام شده با استفاده از نشانگرSRAP28
فصل دوم: مواد و روشها
2-1- انتخاب مناطق و جمعیتها33
2-2- جمعآوری نمونه ها و آماده سازی آنها34
2-3- استخراج DNA از نمونه های گیاهی34
2-3-1- آماده کردن نمونه ها34
2-3-2- استخراج DNA35
2-3-2-1- مواد موردنیاز35
2-3-2-2- روش کار36

2-4- تعیین کیفیت وکمیت DNA37
2-5- واکنش زنجیره ای پلیمراز) (PCR39
2-6- الکتروفورز41
2-6-1- محلول اتیدیوم بروماید42
2-6-2- تهیه ژل الکتروفورز43
2-6-3- الکتروفورز محصول PCR43
2-7- تجزیه و تحلیل داده ها44
فصل سوم: نتایج و بحث
3-1پلیمورفیسم 46
3-2 بررسی پارامترهای اصلی تنوع ژنتیکی همه لوکوسها در جمعیتهای گونهQuercus brantii Lindl. 50
3-3 بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها براساس آنالیز Nei52
3-4 شباهت و فاصله ژنتیکی بین 5 جمعیت54
3-5 بحث و نتیجهگیری کلی55
3-6 پیشنهادات59
منابع62
فهرست شکلها
شکل1- 1 پراکندگی جهانی جنس بلوط (Quercus)6
شکل 1-2 پراکندگی جنس بلوط(Quercus) در ایران7
شکل 1-3 نمایی از گونه Quercus brantii Lindl.10
شکل 1-4 نحوه اتصال پرایمرهای forward و reverse به DNA الگو20
شکل 1-5 واکنش زنجیرهای پلیمراز24
شکل2- 1 جمعیتها و مناطق بررسی شده در این تحقیق33
شکل2-2 نمونههای برگ تازه در آزمایشگاه34
شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر برای تعیین کمیت DNA38
شکل 2-4 دستگاه ترموسایکلر41
شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز عمودی42
شکل 2-6 ساختار اتیدیوم برماید42
شکل 2-7 دستگاه ژل داک43
شکل 3-1 الگوی باندی پرایمر46
شکل 3-2 دندروگرام ژنوتیپ های مورد بررسی55

فهرست جداول:
جدول 2-1 اسامی جمعیتها و مناطق بررسی شده در این تحقیق33
جدول 2-2 مواد استفاده شده در PCR39
جدول 2-3 برنامهPCR 40
جدول 2-4 پرایمرهای مورداستفاده در آزمایش40
جدول 3-1 نتایج کدگذاری آغازگر Me2-Em2 برای همهی جمعیتها47
جدول 3-2 نتایج چندشکلی پرایمرهای استفاده شده در این تحقیق49
جدول 3-3 پارامترهای تنوع ژنتیکی همه لوکوسها در کل نمونهها بر اساس مارکر SRAP51
جدول 3-4 شاخصهای تنوع بین جمعیتی HT، HS، GST و Nem در جمعیتهای Q. brantii53
جدول 3-5 جدول ماتریس تشابه بدست آمده برای نشانگر SRAP در بین جمعیتها54
چکیده
بلوط (Quercus) یکی از مهمترین جنسهای چوبی نیمکره شمالی است. این جنس از اصلیترین گونههای درختی ایران به شمار میرود. تاکسونومی و ارتباط تکاملی جمعیتهای بلوط ایرانی بر اساس مارکرهای مولکولی به طور گستردهای مطالعه نشده است. در این مطالعه، ارتباط ژنتیکی جمعیتهای بلوط با به کارگیری مارکر SRAP امتحان شد. پنج جمعیت بلوط از مناطق مختلف زاگرس شامل یاسوج، برمدشت، بیستون، آبدانان و خوزستان جمعآوری و آنالیز شدند. یازده جفت پرایمر SRAP در کل نمونهها 32 باند از 100 تا 400bp ایجاد کردند. 27 تا از این باندها پلیمورف بودند و درصد پلیمورفیسم38/84% به دست آمد. ضریب تشابه نی محاسبه شد و دندروگرام بر اساس UPGMA از روی دادههای SRAP ترسیم شد. دادههای SRAP با به کارگیری نرمافزار popgene در چهار خوشه دستهبندی شد. آنالیز ژنتیکی دامنه تشابه ژنتیکی بین جمعیتی نسبتاً بالا از حداقل 8818/0 بین یاسوج و برمدشت تا حداکثر 9587/0 بین بیستون و آبدانان را نشان داد. جمعیتهای مطالعه شده بلوط تنوع بالایی را نشان دادند: شمار آلل موثر 46/1 بود و شاخص تنوع ژنتیکی شانون (I) به طور متوسط 69/41% بود. جمعیتهای امتحان شده اختلاف ژنتیکی بین جمعیتی نسبتاً بالایی را (2/0 GST=) نشان دادند و جریان ژنی(Nem) 96/1 بود.
واژههای کلیدی: بلوط، تنوع ژنتیکی، مارکر مولکولی SRAP، نی، پلیمورفیسم
فصل اول:
کلیات
1-1 مقدمه و هدف
بلوط (Quercus) از تیره راش (Fagaceae) یکی از متنوعترین جنسهای درختان نواحی معتدل با بیش از 500 گونه در سراسر جهان است(61). بلوط جزء گیاهان پهن برگ است و اساساً این جنس بومی نیمکره شمالی میباشد و شامل گونههای خزانپذیر و همیشهسبز میباشد که در عرضهای جغرافیایی مختلف آسیا و آمریکا گسترده شدهاست (15). از زمان داروین بلوط به عنوان یک جنس مدل برای مطالعه فرآیندهای تکاملی و گونهزایی به کار میرود، سازگاری بالا و مراحل مختلفی از جریان ژنی بین گونهای به طور معنیداری در پیدایش صدها گونه و زیرگونه و اکوتیپهای متعدد مشارکت داشتهاست(21). از یک طرف این انعطافپذیری فنوتیپی و تنوع ژنی باعث موفقیت این جنس در گونهزایی شدهاست و از طرف دیگر این خاصیت مشکلاتی را در تخمین تنوع ژنتیکی بین گونهها و ساختار ژنتیکی جمعیتها و ارتباط تاکسونومیکی بین گونهها ایجاد کردهاست که باید به طریقی این مشکل رفع شود(30). یکی از علل عمده این تنوع ژنتیکی در بلوط فراوانی تبادل ژنی و دخول بین گونههای جنس بلوط هیبریداسیون میباشد(24).
در حال حاضر با فشار ناشی از تخریب و بهرهبرداری از جنگلها توسط انسان، تغییرات اقلیم و پدیده گرم شدن کره زمین پیشبینی میشود، طی 50 تا 100 سال آینده جمعیت بسیاری از گونههای گیاهی در رویشگاههای کنونی ضعیف و ضعیفتر شده (3) و آینده جنگلهای بلوط را با مخاطرات جدی مواجه سازد. همچنین وجود مشکلاتی نظیر کمبود درختان مادری، تناوب سال بذردهی، آفات و امراض، تولید دانه ناکافی و نامناسب، ضعف دانهزادی و عدم نگهداری دانهها برای مدت طولانی (63)، روند احیاء طبیعی جنگلها را از طریق بذر با مشکل روبرو کردهاست. تدوین برنامه حفاظت از منابع ژنتیکی بلوط و توسعه و احیاء جنگلهای آن از طریق بذرکاری و نهالکاری میتواند از جمله مهمترین و اصولیترین اقدامات احیایی و حفاظتی رویشگاههای این جنس باشد. بطورکلی گزارشات موجود نشان میدهد که در بسیاری از موارد به دلیل ناسازگاری ژنتیکی نهالهای کاشته شده با شرایط محیطی(15)، نرخ پایین زندهمانی آنها(51)، باید توسط بذر ژنوتیپهایی جنگلکاری شود که با شرایط اقلیمی دورههای آینده سازگاری داشته باشد. با این وجود تنظیم و اجرای برنامههای حفاظت از منابع ژنتیکی و جنگلکاری با بذر ژنوتیپهای سازگار با استرسهای احتمالی نیازمند کسب اطلاع از تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها است(53).
علاوه بر اهمیت اکولوژیکی بلوط، این جنس دارای مصارف دارویی، خوراکی و صنعتی فراوان نیز میباشد(28). این جنس یکی از مهمترین گیاهان چوبی تشکیلدهنده جنگلهای بلوط غرب محسوب میشود ولی به دلیل دور شدن این جنگلها از حالت کلیماکس و کاهش قابل توجه گونههای جنگلی تعیین تنوع ژنتیکی و حفاظت ذخایر آنها ضروری به نظر میرسد(23).
مطالعات قبلی مدارک فراوانی را مبنی بر تنوع بینگونهای براساس کاراکترهای فنوتیپی فراهم کردهاند تنوع در این جنس براساس ویژگیهای بیولوژیک، مورفولوژیک و فنولوژیک شناسایی و شرح داده شده است، به خصوص مورفولوژی برگ در این مورد مفید است و ساختار جمعیت بلوطها بر اساس ویژگی مورفولوژیکی برگ مطالعه شده است (61 و 21). تاکنون مطالعه روی تنوع ژنتیکی درون گونهای بلوط ایرانی در مناطق مختلف ایران با استفاده از مارکر SRAP صورت نگرفته است.
مارکرهای مولکولی مهمترین و کاربردیترین سیستمهای مارکری هستند که گستردگی زیادی داشته و هر روزه در حال توسعه و تکامل هستند، و از آنجا که در اولین سطح از بیان ژن مطرح می شوند خیلی دقیق بوده و دارای تنوع زیاد و پلی مورفیسم بالا هستند (15). در بین نشانگرهای مولکولی ریزماهوارهها به دلیل توانمندیهای ویژهای که در شناسایی تنوع ژنتیکی ارقام و گونههای مختلف درختان دارند از کارایی بالایی برخوردارند. هدف از کار حاضر ارزیابی امکان بکارگیری مارکر SRAP در مطالعات ژنتیکی درونگونهای بلوط و مطالعات ژنتیک جمعیت و سنجش تنوع ژنتیکی در جمعیتهای مختلف این گونه و تخمین ساختار ژنتیکی و اختلاف بین جمعیتها در قسمتهای مختلف قلمرو آن در جنگلهای زاگرس است که امید میرود کمکی در جهت طبقهبندی این جنس و بهنژادی این گیاه در آینده باشد.
1-2 گیاهشناسی تیره راش (Fagaceae)
تیره راش (بلوط یا پیالهداران) در جهان دارای 6 جنس و حدود 600 گونه است. درختان یا درختچههایی یکپایه، خزانکننده یا همیشهسبز هستند. برگها متناوب، ساده، کامل، دندانهدار، کنگرهدار یا دارای لوبهای شانهای، دمبرگدار گوشوارکدار که زودافت و در برخی پایا هستند. گلها یکجنسی و در سنبلههای دمگربه ای مجتمعاند. گلهای نر دارای کاسهای کوچک با تعدادی پرچم و گلهای ماده دارای کاسهای کوچک چسبیده به 3 تا 6 برچه با تمکن محوری و تخمدان زیرین و دارای خامه و کلالههای آزاد هستند. در کنار هر برگک سنبلهی ماده معمولا گلآذین گرزنی شامل 3 گل وجود دارد که گاهی فقط یک گل از آن به رشد خود ادامه میدهد. گلهای ماده را اندامی پیالهای شکل حاصل از تراکم برگکهای فلس مانند محصور میکند که همراه با رشد فندقهها رشد میکند و نقش حفاظت فندقه را بر عهده میگیرد. در هر گل فقط یک برچه میتواند به رشد خود ادامه دهد و به یک فندقه تبدیل شود. گاهی گیاهشناسان گیاهان این تیره را به دلیل داشتن کاسه گل پیالهمانند، که به خصوص در بلوط و شاهبلوط قابل توجه است، پیالهداران نیز میگویند (10و8).
1-3 شرح تاکسونومیک جنس بلوط Quercus
بلوط یکی از متنوعترین جنسها از درختان نواحی معتدل است که بر اساس گفتهی محققان شمار گونههای بلوط بین 300 تا 600 متفاوت است (61). در این جنس سنبله نر به شکل شاتون آویخته و محور آن دارای گلهای منفردی با پوششی متشکل از پنج قطعه در قاعده است که به هم متصل شده و دارای 5 یا تعدادی پرچم است. سنبله ماده معمولاً کمگل است و غالباً فقط به یک گل یا دو گل ختم میشود. بخش پایین هر گل را اجتماعی از فلسها به صورت پیاله محصور میسازد. گلپوش دارای 6 قطعه واقع در دو حلقه است. مادگی زیرین و دارای دو تخمک واژگون بوده و خامه به کلاله سهبخشی منتهی است. میوه بصورت فندقه بزرگی با برونبر چرمی است که قاعدهی آن درون پیالهای مقاوم قرار دارد. مادگی در جریان رشد تمام تخمکهای خود را از دست داده و فقط یکی از آنها به رشد خود ادامه میدهد، بنابراین میوه بلوط یک فندقهای است. بیشتر گونههای بلوط درختان بلند جنگلی با تنههای ضخیم و چوبی سخت و مقاوم هستند. بلوطها گاهی بیشتر از 200 سال عمر میکنند (8). بسیاری از گونههای بلوط دارای هر دو نوع تولید مثل جنسی و غیرجنسی هستند. تولید مثل جنسی از طریق تولید دانه و تولید مثل غیرجنسی از طریق پاجوشهای ریشه صورت میگیرد و افراد حاصل در پاسخ به فاکتورهای اکولوژیکی و ژنتیکی متنوع میشوند (14). ردهبندی بلوط بر اساس ردهبندی کرانکوئیست به صورت زیر میباشد:
Kingdom: Plantae
Division: Magnoliophyta
Class: Magnolipsida
Order: Fagales
Family: Fagaceae
Sub Family: Quercoideae
Genus: Quercus
1-3-1 خصوصیات تاکسونومیک گونه Lindl. Quercus brantii
درختی است که هیچگاه مرتفع نیست (شکل1-3)، حداکثر به ارتفاع 10 متر، با پوست خاکستری، شیاردار، شاخههای جوان با کرکهای زرد نمدی یا نمدی خاکستری شونده، جوانهها تخممرغی به طول 2 تا 5 میلیمتر با فلسهای درشت، کرکدار. برگها در زمستان ریزان، در روی سطح فوقانی با کرکهای ستارهای تنک، سطح تحتانی با کرکهای ستارهای زرد یا خاکستریشونده گاهی مخلوط با کرکهای غدهدار پتویی؛ پهنک به طول 6-10 (15-) و عرض 4-7 (9-) سانتیمتر، تخممرغی یا مستطیلی تخم مرغی، با قاعده قلبی، دندانههای 7 تا 14 تایی کوتاه با نوکی به طول 1-2 میلیمتر؛ رگبرگهای فرعی 8-16 جفت، موازی، تا میان دندانهها ممتد (در میان دندانهها نفوذ می کند)؛ رگبرگهای بینابینی (فرعیتر) وجود ندارد؛ دمبرگ به طول 1-2 سانتیمتر. گل آذین دمگربهای نر به طول 4-6 سانتیمتر، با محور کرکدار؛ گلپوشهای نر با بریدگیهای پهن 4-6 تایی کمعمق (هیچگاه بریدگیها عمیق نیستند)، بریدگیها به نیمه گلپوش نمیرسند؛ پرچمها 5-7 تایی. گلهای ماده منفرد یا دوتایی، با محوری به طول 15 سانتیمتر. پیاله نیمهکروی یا مخروطی که 20 تا 50 درصد میوه را در بر میگیرد، به ارتفاع 2-3 سانتیمتر وقطر 4 سانتیمتر، با فلسهای درشت، کرکدار، به صورت افقی گسترده. میوه بلوط به طول تا 5 سانتیمتر، با زخم محدب. این گونه اغلب گال ایجاد میکند(11).
-4 پراکندگی جهانی این جنس

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

این جنس بومی نیمکره شمالی (اروپا، افریقا، آمریکای شمالی و آسیا مخصوصا در جزایر پلینزی در اقیانوس آرام) است (14) و از نواحی قطبی تا نواحی نیمهخشک پراکنده شدهاست (16). مکزیک یکی از مراکز تنوع جنس بلوط است که دارای 135 تا 150 گونه شامل 86 گونه اندمیک میباشد (61)(شکل1-1).
شکل1- 1 پراکندگی جهانی جنس بلوط (Quercus)
1-5 پراکندگی این جنس در ایران
در ایران نیز چند گونه بلوط در جنگلهای شمال و غرب ایران انتشار دارند Q. macranthera با نام محلی اوری و Q.castanefolio با نام محلی مازو از مهمترین جنگلهای شمال و ارسباران هستند (5). جنگلهای زاگرس که جنگلهای بلوط غرب نیز نامیده می شود با طول تقریبی 1300 کیلومتر در امتداد رشتهکوه زاگرس از جنوب آذربایجان غربی تا استان فارس ادامه دارند (21 و 14). درخت بلوط از بارزترین گیاهان درختی به شمار میرود (21). زاگرس جنوبی رویشگاه خالص گونه Q.brantii Lindl. یا بلوط ایرانی میباشد(شکل1-2).
شکل 1- 2 پراکندگی جنس بلوط(Quercus) در ایران
1-6 شرایط اکولوژیکی
درخت بلوط در خاک پررس مرطوب رشد میکند ولی خاکهای شنی را نیز تحمل میکند. این درخت در مناطق جنگلی و پست یافت میشود. جنگلهای بلوط به دوره کوتاه خشکی در تابستان و باران زیاد در بهار نیاز دارند (2).
1-7 ترکیبات شیمیایی بلوط
در پوست و برگ درختان بلوط تاننهایی وجود دارد که از نظر ترکیب شیمیایی مشابهت نزدیک با یکدیگر دارند. پوست شاخههای جوان برخی گونههای دارویی دارای 10 تا 20 درصد (در شاخههای مسن 0 تا 10 درصد) از نوعی تانن فیزیولوژیکی یعنی اسید کوئرسیتانیک1 محلول در آب، نوعی قند محلول در آب به نام کوئرسیت2، 6/1 درصد اسید گالیک، اسید مالیک، یک ماده تلخ به نام کوئرسین3 ، فلوروگلوسین، موسیلاژ، مواد پکتیکی، مواد رزینی، اکسالات کلسیم و نوعی ماده رنگی قرمز به نام قرمز بلوط و به مقدار کم از کولاکاتشین4 و غیره است. میوه دارای 5 درصد ماده روغنی، 65/6 درصد پروتئین، 7 درصد از قندهای مختلف، 3/44 درصد آمیدون، 2/3 درصد پنتوزان، مقدار کمی کوئرسیت و معادل 7 درصد از نوعی تانن است. در گال که بر روی برگ و جوانههای بلوط تحت اثر گزش حشرات مخصوص از دسته نیمبالان، ایجاد میشود نوعی تانن به نام اسید گالوتانیک5 یافت میشود که سابقا آن را انیدریدی از اسید گالیک تصور مینمودند و در نتیجه آن را اسیددیگالیک6 نوعی گلوکوزید تصور میکردند (4).
1-8 اهمیت درمانی بلوط
اهمیت درمانی درختان بلوط بیشتر مربوط به تاننی است که در اندامهای آن فراهم میشود. این ماده را باید یکی از شاخصترین موادی دانست که در عالم گیاهان تولید میشود. این ماده مهم گیاهی خواص مختلفی نظیر رسوب دادن آلبومین، به وجود آوردن پوشش محافظ برای بافتها، جلوگیری کردن از عفونیشدن و غیره را داراست. طبق بررسیهایی که به عمل آمده است فراوردههای تانن تاثیر مثبتی در درمان سل، التیام زخمها و جلوگیری از ترشحات مخاط دارند. اعضای مختلف درختان بلوط به علت دارا بودن تانن اثر قابض، بند آوردن خون و تقویتکننده عمل بعضی از اعضای بدن را دارند. برگ بلوط در بیماریهای مختلف مانند اختلاط خونی، خونرویهای مختلف، زخم معده، آغاز بیماری سل، دیسانتری، بیاختیاری دفع ادرار در اطفال، رفع ترشحات زنانگی و بواسیر اثر قاطع دارد. در استعمال خارجی، جوشاندههای غلیظ آن به صورت غرغره در معالجه ورم حنجره و لوزه مؤثر واقع میشود.
پوست درخت بلوط (Q. robur) پادزهر خوبی در مسمومیتهای ناشی از آلکالوئیدها است و اثر غیرقابلانکاری در رفع خونرویها، اختلاط خونی، سل، نرمی استخوان و غیره دارد (پوست گونههای دیگر به علت دارا بودن تانن فراوانتر کمتر در مصارف داخلی بکار میروند). باید توجه داشت مصرف زیاد یا طولانی مدت آن باعث خستگی عضلات معده، احساس درد عضله قلب و تحریک دستگاه هضم میشود. ارزش درمانی پوست بلوط در استعمال خارج، بیشتر از مصارف داخلی آن است مانند آن که استعمال جوشاندههای گرد پوست بلوط، به صورت حمامهای موضعی، لوسیون، غرغره، تنقیه و شستشو به صورتهای مختلف، جهت درمان بیماریها در موارد اولسرهای سرطانی، التهاب غدد به علت انسداد مجاری آنها، خونمردگی سوداء، بیماریهای مزمن پوستی دیگر، اگزما، واریس، خیز عمومی بدن و غیره میتوان استفاده کرد. از لوسین موجود در پوست درخت بلوط، در موارد انسداد مجاری لنفاوی، دررفتگی اعضا، جمع شدن آب در مفاصل، سرمازدگی، اولسرهای عفونی و اولسرهای قانقاریایی چرکین نیز استفاده میشدهاست، به علاوه آن را در موارد بروز ترشحات مهبلی و سوزاکهای مزمن و غیره هم بکار میبردهاند.
میوه بلوط جهت رفع اسهال و درمان دیسانتری، سوءهاضمه، درد معده، نزلههای مزمن، کمخونی، نرمی استخوان، سیاهسرفه، درمان سل در مراحل اولیه، سستی و ضعف استخوانها و غیره به کار میرود. مخلوط آرد میوه بلوط بوداده با کاکائو، بهترین دارو جهت رفع اسهالهای ساده اطفال است.
گالها به عنوان مقوی معده، قابض و رفعکننده خونرویها به کار میروند (4).
1-9 مصرف خوراکی بلوط
میوه فندقه درختان بلوط که عموماً در پیالهای جای دارد و آکورن نامیده می شود، از قدیم مورد استفاده مردم دنیا بودهاست. طعم آن در بعضی گونهها مانند Q. ballota Desf مخصوصاً نژادی از آن که در الجزیره و اسپانیا میروید بسیار مطبوع است. بعضی از گونههای آمریکا و برخی از انواع موجود در ایران نیز میوههای خوراکی دارد و از آنها برای تغذیه استفاده میشود. از مخلوط آرد میوه درشت بلوط با آرد گندم، در بعضی نواحی نان تهیه میشود. در دورانهای قبل میوه بلوط را بو میدادند تا تانن آن با این عمل کاهش یابد سپس از آن در تهیه نوعی قهوه استفاده میکردند، این قهوه دارای دکسترین به جای آمیدون میوه است (4). میوه بلوط هم به صورت مستقیم مورد تغذیه دام و وحوش قرار میگیرد و هم جمعآوری شده و به عنوان علوفه زمستانی مورد تغذیه دام قرار میگیرد (2).
1-10 اهمیت اقتصادی بلوط
درخت بلوط از مهمترین درختان جنگلی ایران محسوب میشود. چوب آن دارای مصارف صنعتی است. چوب بلوط دارای چگالی g/cm375/0 بوده و استحکام و سختی زیادی دارد و نسبت به حشرات و حمله قارچها بسیار مقاوم است و بافت بسیار جالبی دارد. پوست و گالهای درخت بلوط هم سرشار از تانن هستند و در صنعت چرمسازی و رنگسازی مورداستفاده قرار میگیرد (5).
شکل 1-3 نمایی از گونه Quercus brantii Lindl.
1-11 تنوع ژنتیکی :
تنوع ژنتیکی به تنوع ژنی درون گونهها اطلاق میشود. به عبارتی تنوع ژنتیکی، تنوع قابل توارث درون و بین جمعیتهاست. کلیه تنوعهای موجود با توالی چهار جفت باز تشکیلدهنده مولکول DNA، اجزا سازنده کدهای ژنتیکی مرتبط میباشند. انواع دیگری از تنوع ژنتیکی را نیز میتوان در کلیه سطوح سازماندهی شده در هسته شامل مقدار DNA، تعداد کروموزم و ساختار DNA شناسایی کرد. تنوع و تکامل ژنتیکی در جمعیتهای گیاهی میتواند بوسیله جهش، نوترکیبی، مهاجرت، رانده شدن ژنتیکی و گزینش ژنتیکی ایجاد شده باشد (64). کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی در بین افراد یا جمعیتها و آگاهی از روابط خویشاوندی گونههای موردنظر در برنامههای اصلاحی، امکان سازماندهی ژرمپلاسم و نمونهگیری مؤثر از ژنوتیپها را فراهم میسازد (1). قدم اول در اصلاح خصوصیات گیاهی، فهم از ساختار کلکسیون ژرمپلاسم است که این موضوع به نوبه خود نمونهگیری سیستماتیک ژرمپلاسم را برای مقاصد اصلاحی و حفاظتی امکانپذیر میسازد. برای بهرهبرداری از منابع ژنتیکی با حداکثر کارآیی، شناخت مواد ژنتیکی نگهداری شده ضرورت دارد. ارزیابی نمونهها میتواند با توجه به هدف استفاده از ژرمپلاسم صورت گیرد که جنبههای اگرونومیکی، پاتولوژیکی، مورفولوژیکی، سیتولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی از جمله این اهداف است. در راستای این ارزیابی نقاط قوت و ضعف تودهها و ژنوتیپها و پتانسیلهای موجود در آنها شناخته میشود. به عبارت دیگر در این ارزیابیها وسعت پایه ژنتیکی هر صفت معلوم میگردد (12 ،7 و6) تنوع ژنتیکی یک صفت معین، اندازه پراکنش ارزشهای همان صفت است، به طوری که تأثیر محیط بر آن زدوده شده باشد. تنوع بین گیاهان یک گونه گیاهی خاص بر دو نوع است: تنوع بر اثر محیط، که به مقادیر مختلف تنش محیطی واکنش میدهد و با مقایس? گیاهان دو جمعیتی که از لحاظ ژنتیکی یکنواخت هستند، میتوان آنرا مشاهده نمود. تأثیر محیط روی یک گیاه، به نتاج آن منتقل نمیشود و بنابراین انتخاب در یک جامعه یکنواخت ژنتیکی، به جدا نمودن نژادهایی که در واکنش به تنشهای محیطی اختلاف دارند، نمیانجامد. تنوع ارثی به تنوع موجود در یک جمعیت مخلوط ژنتیکی، که از عوامل ارثی ناشی شده و به نتاج انتقال مییابد، اطلاق میگردد .از آنجایی که این نوع تنوع، ناشی از عوامل ارثی است و به نتاج قابلیت انتقال دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامههای اصلاحی حائز اهمیت است، منشأ تنوع ارثی در گیاهان، نوترکیبیهای ژنتیکی، تغییرات درکروموزومها و جهشها است (7).
1-11-1 اهمیت تنوع ژنتیکی و روشهای مختلف ارزیابی آن
شناخت کیفی و کمی تنوع ژنتیکی از اهمیت زیادی در علوم بیولوژی مانند اکولوژی، بیولوژی تکامل، تاکسونومی یا ردهبندی، ژنتیک و اصلاح نباتات برخوردار است. اهمیت تنوع ژنتیکی به خوبی برای همه روشن بوده و نشان داده شده است که کاهش تنوع ژنتیکی میتواند منجر به کاهش شایستگی و سازگاری به تغییرات محیطی گردد. ارزیابی تنوع ژنتیکی معمولاً در سطح مولکولی و با استفاده از چندین روش آزمایشگاهی انجام می‌گیرد که از آن میان می‌توان به آللوزایمها7 ، آنالیز DNA8 و ایزوزیم9ها اشاره کرد که قادرند ارزیابی دقیقی از تنوع ژنتیکی را فراهم نمایند. ارزیابی ترکیب ژنتیکی گیاهان زراعی و مجموعههای ژنتیکی و قرابت بین آنها از گذشتههای دور معمول بوده است، بطور تاریخی این تخمین براساس بیولوژی اندامهای جنسی، دادههای اکوجغرافیایی، زیستشناسی، رنگیزهها و شجرهنامه و اخیراً با استفاده از نشانگرهای پروتئینی مانند ایزوزایم صورت میگرفته است همچنین تنوع ژنتیکی ممکن است با استفاده از صفات مورفولوژیکی نیز مورد ارزیابی قرار گیرد. بررسی صفات مورفولوژیکی به تکنولوژی گرانی نیاز ندارد ولی اغلب، این فعالیتها به زمین وسیعی نیاز دارند که این امر می‌تواند سبب شود که این روش نسبت به روش‌های مولکولی هزینه بیشتری داشته باشد. بعلاوه این صفات اغلب تحت تأثیر نوسانات محیطی قرار می‌گیرند که موجب می‌شود ارزیابی تنوع تحت تأثیر محیط باشد. با بررسی مجموعههای ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA، تفاوتهای ژنتیکی بیشتری مشاهده شده، این تفاوتها تحت تأثیر محیط و اثراتی مانند پلیوتروپی، اپیستازی و دوره رشدی گیاه نخواهند بود و امکان آگاهی دقیق و کافی از تنوع ژنتیکی در سطح DNA را فراهم میسازند. با توجه به اهمیت روزافزون تولید واریتههای برتر و نیاز به شناسایی و استفاده از آللها و ژنهایی که صفات مطلوبی را کنترل مینمایند، استفاده از نشانگرهای DNA روزافزون خواهد بود.
1-12 انواع نشانگرها:
مارکرها انواع مختلفی دارند. در یک تقسیمبندی کلی میتوان مارکرها را به صورت زیر دستهبندی کرد:
1- مارکرهای مورفولوژیکی یا فنوتیپی
2- مارکرهای مولکولی
مارکرهای مولکولی خود به دو دسته تقسیم میشوند:
1- مارکرهای بیوشیمیایی
2- مارکرهای DNA
1-12-1 نشانگرهای مورفولوژیکی
مارکرهای مورفولوژیکی همانگونه که از نام آنها مشخص است از روی فنوتیپ ارزیابی میشوند و لذا ارزیابی آنها خیلی ساده است. تعداد این مارکرها کم است و پلیمورفیزم کمی نیز تولید میکنند. از طرفی در اغلب موارد مارکر فنوتیپی در واقع یک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگی بوته، ابلق بودن برگ ها و … . لذا امروزه از این نوع مارکرها استفاده نمیشود. نشانگرهای مورفولوژیکی اولین نشانگرهایی بودند که برای ارزیابی تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفتند (20). نشانگرهای مورفولوژیک که پیامد جهشهای قابل رویت در مورفولوژی هستند، شامل دامنه وسیعی از ژن‌های کنترلکننده صفات مورفولوژیک میشوند که بر ظاهر یا فنوتیپ موجود مبتنی بوده و جزو نخستین نشانگرها به شمار میآیند که از زمانهای بسیار دور، یعنی زمانی که هنوز محل ژن روی کروموزوم مشخص نشده بود، مورد استفاده قرار میگرفتند. دلایل عمده محدودیت استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی عبارتند از: تعداد این نشانگرها کم بوده، وابسته به سن و مرحله رشدی گیاه هستند و غالباً از شرایط محیطی تأثیر میپذیرند و درضمن اساس ژنتیکی بسیاری از آنها هنوز مشخص نشده است. در صورتی که هنوز بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس صفات مورفولوژیک یک گام اولیه در جهت توصیف و گروهبندی ژرمپلاسمها است (57).
1-12-2 نشانگرهای بیوشیمیایی
نشانگرهای بیوشیمیایی شامل موارد متعددی است. این نوع مارکرها نیز امروزه کارایی زیادی ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پلیمورفیزم کافی ایجاد نمیکنند، لیکن نکته مثبت در آنها همبارز بودن است.
این گروه را میتوان به دستههای زیر تقسیم کرد:
الف. مولکولهای بیوشیمیایی کوچک: مثل ترکیبات فنلی، ترکیبات معطر و …
ب. پروتئینهای ذخیرهای: مثل گلوتنین و گلیادین که در گندم خصوصا در تعیین ارزش نانوایی کاربرد دارد.
ج. آیزوزایمها: اینها در واقع فرمهای مختلف یک آنزیم هستند که یک واکنش را کاتالیز میکنند ولی ممکن است سرعت فعالیت آنها متفاوت باشد. این مارکرها در دهه 80 کاربرد زیادی داشتند. تنکسلی توانست بر اساس آیزوزایمها در گوجه فرنگی اولین نقشه لینکاژی را طراحی نماید. و معایب آیزوزایم‌ها عبارتند از: تنها تعداد محدودی آیزوزایم برای هر گونه وجود دارد، تعداد سیستم‌های آنزیمی چند شکل و قابل دسترس محدود است و مکان‌های آنزیمی فقط شامل قسمت محدود و غیرتصادفی از ژنوم هستند (قسمت بیانشونده). بنابراین تنوع مشاهده شده ممکن است بیانگر کل ژنوم نباشد. اگرچه با این روش می‌توان تعداد زیادی از نمونه‌ها را بررسی کرد ولی مقایسه نمونه‌ها از گونه‌های مختلف، مکان‌های ژنی و آزمایشگاه‌های مختلف مشکل ساز است. بطوریکه این روش تحت تأثیر روش‌های استخراج، بافت گیاه و مرحله رشد گیاه قرار می‌گیرد(62و42).
د. آللوزایم‌ها آلل‌های متفاوت آنزیم‌ها هستند که یک ارزیابی از فراوانی ژنی و ژنوتیپی در درون و بین جمعیت‌ها ارائه می‌دهند که این اطلاعات می‌توانند جهت گروه‌بندی جمعیت‌ها، تنوع ژنتیکی، جریان ژن، ساختار ژنتیکی گونهها، مقایسه میزان تلاقی‌های بین‌گونه‌ای، ساختار جمعیت و واگرایی جمعیت‌ها استفاده شوند (42).
مزیتهای مهم این‌گونه نشانگرها عبارتند از: ارزیابی به صورت هم‌بارز و بدون دخالت تأثیرات اپیستازی و پلیوتروپی، کاربرد آسان و هزینه پائین.
1-12-3 نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA
مارکرهای DNA در واقع مهمترین و کاربردیترین سیستمهای مارکری هستند که گستردگی زیادی داشته و هرروزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولین سطح بیان ژن مطرح میشوند، خیلی دقیق بوده، دارای تنوع زیاد و پلیمورفیزم بالا هستند.
نشانگرهای مولکولی بر اساس آشکارسازی تفاوت‌ (چندشکلی10) موجود در بین اسیدهای نوکلئیک افراد مختلف عمل می‌کنند. این تفاوت‌ها شامل پدیده‌های حذف، اضافه، جابجایی، دو برابر شدن و جهش‌های نقطه‌ای است و تنها ژن‌های خاص و فعال را شامل نمی‌شود. نشانگرهای مولکولی علاوه بر اینکه تحت تأثیر محیط نیستند دارای مزیت‌های زیر میباشند:
1- تمام قسمت‌های ژنوم را پوشش می‌دهند (اگزون‌ها، اینترون‌ها و نواحی تنظیمکننده).
2- تحت تأثیر پلیوتروپی و اپیستازی قرار نمی‌گیرند.
3- قادر به شناسایی تفاوت‌هایی هستند که تنوع فنوتیپی نشان نمی‌دهند.
4- بعضی از آنها هم‌بارز هستند.
روش‌های مختلف مورد استفاده شامل: هضم و هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک، روشهای مبتنی بر واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (11PCR) و یا ترکیبی از دو روش ذکرشده هستند. بعلاوه روش‌های مختلف نشانگری می‌توانند یک مکان یا چند مکان ژنومی را مورد بررسی قرار ‌دهند. بطوریکه نشانگرهای چند مکانی12 قادرند بطور همزمان چندین مکان ژنومی را مورد بررسی قرار دهند. این نشانگرها مبتنی بر تکثیر تصادفی DNA بواسطه آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی با توالی‌های انتخابی هستند، این گونه نشانگرها را نشانگر‌های غالب نیز می‌نامند. بنابراین امکان تشخیص حضور یا عدم حضور باند برای هر مکان وجود دارد ولی امکان تشخیص حالت‌های هتروزیگوت (A/-) یا هموزیگوت (a/a) برای آلل‌های مشابه وجود ندارد. در حالیکه نشانگرهای یک مکانی13 از کاوشگرها یا آغازگرهای ویژه برای مکان‌های ژنی استفاده می‌کنند و قادر به تکثیر یا دورگگیری DNA با توالی‌های شناختهشده هستند. این نشانگرها را نشانگرهای هم‌بارز نیز می‌نامند که امکان تشخیص مکان‌های هموزیگوت و هتروزیگوت را به ما می‌دهند(42).
روش‌های نشانگری پایه را می‌توان به 2 دسته تقسیم کرد:
1-روش‌های غیر مبتنی بر PCR یا روش‌های مبتنی بر هیبریداسیون.
2-روش‌های مبتنی بر PCR
1-12-3-1 روش‌های غیر مبتنی بر PCR
روشهای مولکولی مبتنی بر هیبریداسیون از اولین نشانگرهایی هستند که در مطالعات گیاهی مورداستفاده قرار گرفتند. این نشانگرها شامل استفاده از آنزیم‌های برشی و روش‌های دورگگیری بودند (59). آندونوکلئارهای هضمکننده، آنزیم‌های باکتریایی هستند که قادر به شناسایی توالی‌ پالیندرم ویژه و برش DNA هستند که این برش سبب ایجاد قطعاتی با اندازه‌های مختلف می‌شود. تغییرات درون توالی (مثل جهش نقطه‌ای)، جهشهای بین مکانی (مثل حذف و جابجایی) و جهشهای درون مکان آنزیمی می‌توانند منجر به تفاوت طول قطعات بعد از برش آنزیمی شوند. نشانگرهای RFLP14 و تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری (15VNTR)، نمونه‌هایی از نشانگرهای مبتنی بر هضم و هیبریداسیون هستند. در RFLP چندشکلی DNA بوسیله هیبریداسیون کاوشگر (که به روش شیمیایی نشاندار شده است) با قطعاتDNA انتقال سادرنیافته انجام می‌گیرد که سبب ایجاد پروفایلهایی از قطعات DNA میشود. نشانگر RFLP دارای چندشکلی نسبتاً زیادی است، توارث همبارز داشته و تکرارپذیری بالایی نشان می‌دهد. در این روش لکه‌های DNA حاصل از دورگ گیری را می‌توان پاک کرد و قطعات انتقال سادرنیافته را دوباره با کاوشگرهای 16‌ RFLP جدید (8 تا 10 مرتبه) مورد بررسی قرار داد. با این وجود، این روش‌ها به علت وقت‌گیر بودن، داشتن مواد رادیواکتیویتهی گرانقیمت و سمی و نیاز به DNA با کیفیت و کمیت بالا به طور وسیع مورداستفاده واقع نمی‌شوند. بعلاوه این نشانگرها به اطلاعات اولیه از توالی DNA‌ جهت ساختن کاوشگر نیاز دارند که سبب پیچیدگی روش می‌شود. این محدودیت‌ها سبب شده است که روش‌های با پیچیدگی کمتر مانند نشانگرهای مبتنی بر PCR توسعه یابند (42). بازرترین نوع این مارکرها، RFLP میباشد. VNTRها و میکروستلایتها نیز در این گروه قرار دارند. در این نوع مارکرها یک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هیبریداسیون استفاده میشود. RFLP در سال 1980 توسط Botstain ابداع شد و دقت بسیار زیادی دارد، لیکن امروزه صرفا به دلیل وقتگیر و پرزحمت بودن آن، کمتر استفاده میشود.
1-12-3-2 نشانگرهای مبتنی بر PCR
این نشانگرها که کاربرد آنها سیر صعودی دارد، توسط مولیس و همکارانش (1986) توسعه پیدا کرده و از واکنش‌های زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) پیروی می‌کنند. این تکنیک شامل تکثیر چندین قطعه DNA مجزا است که توالی‌های اطراف آنها بسیار مشابه آغازگر می‌باشد، این نواحی باید به قدر کافی به همدیگر نزدیک باشند تا تکثیر انجام گیرد. استفاده از آغازگرهای تصادفی محدودیت داشتن اطلاعات اولیه برای انجام PCR را ندارد. روش‌های مبتنی بر PCR را می‌توان به دو گروه: 1- روش‌های مبتنی بر PCR توالیهای غیر ویژه. 2- روشهای مبتنی برPCR توالی‌های هدف17 تقسیم کرد. در این قسمت تعدادی از نشانگرهای مبتنی بر PCR توضیح داده میشود (42).
1-12-3-2-1 نشانگرRAPD18:
نشانگر RAPD، نخستین نشانگر مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره پلیمراز بود که برای بررسی تنوع ژنتیکی مورداستفاده قرار گرفت. مارکرهای RAPD از طریق تکثیر تصادفی DNA ژنومی و با استفاده از آغازگرهای کوتاه ایجاد میشوند. تفکیک قطعات حاصل بر روی ژل آگارز در حضور اتیدیوم بروماید صورت میگیرد، و در نهایت، زیر نور ماوراء بنفش مشاهده میگردد. اگرچه آغازگرها دارای توالیهای تصادفی هستند، قادر به یافتن توالیهای هومولوگ مناسب روی رشته DNA میباشند. چندشکلیهای DNA بدلیل نوآرایی یا حذف در محل اتصال آغازگرها یا ناحیه قابل تکثیر ایجاد میشوند (68).
1-12-3-2-2 نشانگر19AFLP:

دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید